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与CENVISIONISP大切诺基/Cas系统相守相杀的抗CPRADOISPENCORE蛋白切磋最新进展

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到目前为止,I型CRISPR为精确基因编辑提供了有限的实用性,但它可以用作对抗抗生素抗性细菌菌株的工具。

2016年7月25日,国际学术权威刊物自然出版集团旗下子刊《Nature Structural &
Molecular
Biology》杂志上在线发表了浙江大学生命科学研究院朱永群实验室题为“Structural
Basis for Cas3 Inhibition by the Bacteriophage Protein
AcrF3”的研究论文,研究揭示噬菌体蛋白AcrF3抑制病原菌I型CRISPR-Cas免疫系统效应分子Cas3的分子机理。国家蛋白质科学中心的姚德强博士和朱永群实验室博士生王小飞为论文共同第一作者,朱永群教授和助理研究员周艳博士为本文的共同通讯作者。

首先,CasX的一大重要应用特点是分子小巧。CasX只有不到1000个氨基酸,比Cas9或Cas12a都要小得多,甚至比起以分子量小为特点的新工具Cas12b,还要更胜一筹。

科学家可以通过基因工程识别致病基因。这涉及将人造DNA添加到细菌细胞中。然而,问题是细菌已经进化出复杂的防御系统以防止外来入侵者

特别是外来的DNA。目前的基因工程方法经常将人造DNA伪装成细菌DNA以阻止这些防御,但是该过程需要高度特异性的修改并且昂贵且耗时。

在最近发表在美国国家科学院院刊上的一篇论文中,克里斯托弗约翰斯顿博士和他在Forsyth研究所的同事们描述了一种通过使人造DNA对细菌的防御不可见而对细菌进行基因工程的新技术。理论上,该方法可以应用于几乎任何类型的细菌。

Johnston是Fred
Hutchinson癌症研究中心疫苗和传染病部门的研究员,也是该论文的主要作者。他说,当一个细菌细胞检测到它已被外来DNA穿透时,它会迅速摧毁侵入者。细菌一直受到病毒攻击的威胁,因此它们已经开发出非常有效的防御措施来抵御这些威胁。

约翰斯顿解释说,问题在于,当科学家们想要将人造DNA放入细菌中时,他们会面对完全相同的防御系统,以保护细菌免受病毒侵害。

为了克服这个障碍,科学家们添加了特定的修改来掩盖人造DNA并诱使细菌认为入侵者是其自身DNA的一部分。这种方法有时可行但可能需要相当长的时间和资源。

约翰斯顿的策略是不同的。他没有在人造DNA中加入伪装,而是删除了一种称为基序的基因序列的特定成分。细菌防御系统需要这个主题来识别外来DNA并进行有效的反击。通过去除基序,人造DNA变得对细菌的防御系统基本上是不可见的。

想象一下像干船坞中的敌人潜艇这样的细菌,以及作为你的士兵的人造遗传工具,需要进入潜艇进行特定的任务。目前的做法就像将间谍伪装成敌人一样士兵,让他们走到每个门口,允许警卫检查他们的凭据,如果一切顺利,他们就在,约翰斯顿说。我们的方法是让那名士兵看不见,让他们直接穿过大门,完全躲避守卫。

这种新方法比现有技术需要更少的时间和更少的资源。在这项研究中,约翰斯顿使用金黄色葡萄球菌作为模型,但他开发的潜在策略可以用于潜行这些主要的防御系统,这些系统存在于当今已知的80%至90%的细菌中。

这种新的基因工程工具为以前未经过充分研究的细菌研究开辟了可能性。约翰斯顿解释说,由于科学家的时间和资源有限,他们倾向于使用已经被破坏的细菌。使用这种新工具,解决细菌DNA的主要障碍已经解决,研究人员可以使用该方法设计更多临床相关细菌。

细菌是我们这个星球的驱动力,Forsyth研究所的高级研究员,该论文的共同作者Gary
Borisy博士说。设计细菌的能力对医学,农业,化学工业和环境都有深远的影响。

科学家们假设这些状态存在,但他们缺乏视觉证明它们的存在,罗说。现在,看到真的相信。

CRISPR/Cas9基因组编辑正快速地引发生物医学研究变革,但是这种新技术迄今为止并不是非常精确的。这种技术能够在基因组中无意地产生过多的或者不想要的变化,产生脱靶突变,从而限制了它在治疗应用中的安全性和疗效。如今,在一项新的研究中,来自美国马萨诸塞大学医学院和加拿大多伦多大学的研究人员发现首批已知的CRISPR/Cas9活性“关闭开关”,从而为CRISPR/Cas9编辑提供更好的控制。

CasX具有不同于此前几款Cas核酸酶的独特优点。

细菌无处不在。他们生活在土壤和水中,皮肤上和身体中。有些是致病的,这意味着它们会引起疾病或感染。为了设计针对病原体的有效治疗方法,研究人员需要知道哪些特定基因应归咎于致病性。

除了我们的系统在蛋白质识别水平上起作用外,虫子的免疫系统与我们的效率一样有效,而CRISPR在核酸识别水平上起作用,分子生物学和遗传学教授Ailong
Ke解释道。

为了研究 AcrIIA2 或 AcrIIA4 是否能够直接结合
SpyCas9,课题组首先建立体外生物化学研究系统,研究发现 Anti-CRISPR 蛋白
AcrIIA2 或 AcrIIA4 直接结合 SpyCas9-sgRNA 复合物,有趣的是 AcrIIA2 或
AcrIIA4 只和结合有 sgRNA 的 SpyCas9 有相互作用,而和单独 SpyCas9
并没有相互作用;进一步实验发现 AcrIIA2 或 AcrIIA4 能够直接抑制 SpyCas9
介导的目的 DNA 的剪切。

“基因组编辑工具的免疫原性、传递性和特异性都至关重要。”论文的作者之一Benjamin
Oakes在加州大学伯克利分校官网的一篇新闻稿中如此表示。Oakes曾在加州大学伯克利分校攻读研究生,目前是创新基因组研究所的创业研究员,
“我们对CasX在所有这些领域的表现感到兴奋。”

通过拍摄一系列近原子分辨率的快照,康奈尔大学和哈佛医学院的科学家们一步一步地观察了细菌如何抵御外来入侵者,如噬菌体,一种感染细菌的病毒。

利用一种被称作冷冻电镜的高分辨率成像技术,这些研究人员发现了CRISPR系统和抗CRISPR蛋白的三个重要的方面。

尤其是最早开发的Cas9,目前已经证明自己是一个强大的基因编辑器,被广泛应用于人类、植物、动物和细菌中,能够快速准确地剪切和拼接DNA,为治疗疾病开辟新途径。

该研究结果于6月29日发表在Cell杂志上,提供的结构数据可以提高生物医学CRISPR操作的效率和准确性。这种防御机制的方面

马萨诸塞大学医学院RNA治疗研究所教授Erik J.
Sontheimer博士、多伦多大学分子遗传学教授Alan
Davidson博士和多伦多大学生物化学助理教授Karen
Maxwell博士鉴定出三种自然产生的抑制Cas9核酸酶的蛋白。这些被称作抗CRISPR的蛋白具有阻断Cas9切割DNA的能力。

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在第一次遇到时,细菌将一些入侵者的DNA插入到CRISPR位置的自己的基因组中。需要时,存储的DNA的RNA转录物(称为指导RNA)可以与其他蛋白质组装成称为Cascade(CRISPR相关复合物用于抗病毒防御)的复合物。该系统非常高效和精确,以至于研究人员已经想到了将其重新用于基因组编辑应用的方法,以及在DNA的精确位置引入变化。在我们发言时,一场CRISPR革命席卷了生物学,柯说。

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CasX独特的小巧结构暗示了它通过独特的机制识别和编辑底物DNA。根据冷冻电镜等结构数据,研究人员发现,CasX除了有某些与其他核酸酶成员同源的结构域外,还具有其它Cas蛋白中未曾发现的特征。比如,CasX含有一个参与DNA解螺旋的结构域,其反式切割活性也比其它Cas系统要少。

柯与哈佛医学院细胞生物学助理教授廖茂夫合作,他是一位使用低温电子显微镜确定在冰层中冷冻的大分子高分辨率结构的专家。使用用于发酵的细菌Thermobifida
fusca,Ke的实验室制备了代表免疫反应的不同阶段的样品。廖和他的博士后研究员罗敏冻结了这些样本,并在每一步拍摄了高分辨率的快照。该研究的重点是特定版本的CRISPR相关防御,称为IE型。

Davidson和同事们然后测试了在质粒中表达的每种假定的抗CRISPR基因是否能够支持噬菌体在携带靶向它的I-E型或I-F型CRISPR系统的细菌内复制。他们又鉴定出4种靶向作用于I-F型CRISPR系统的抗CRISPR基因,以及一种能够阻断I-E型和I-F型CRISPR系统的抗CRISPR基因。4.mBio:鉴定出新的一组抑制铜绿假单胞菌I-E型CRISPR-Cas系统的噬菌体抗CRISPR基因doi:10.1128/mBio.00896-14

2012年6月,
Doudna率先拉开第三代基因编辑技术CRISPR-Cas9的大幕,但在随后的专利竞争中,一度被麻省理工学院和哈佛大学的博德研究所张锋团队占尽优势。

Ke和Xiao与同一期Cell杂志合着了另一篇论文,与德克萨斯大学奥斯汀分校生物科学助理教授Ilya
Finkelstein一起描述了Cascade如何在单分子水平上搜索目标。

鉴于已知Cas9核酸内切酶在细胞内逗留太久会导致脱靶效应,科学家们正在努力开发Cas9关闭开关在理想的情况下,Cas9会发现完美的靶标,随后一种Cas9抑制剂阻止这种酶发生额外地切割。如今有研究证实病毒进化出的反制措施,即被称作抗CRISPR蛋白的抑制性蛋白,能够被用来改进作为一种基因治疗工具的CRISPR-Cas9,从而降低可能导致不良副作用的脱靶基因编辑。

论文第一作者Jun-Jie Liu和Natalia
Orlova使用冷冻电镜捕捉到了CasX蛋白在编辑基因过程中的快照图像,基于这种蛋白质独特的分子组成和形状,研究人员得出结论,CasX的进化独立于Cas9,没有共同的祖先。

为了解决特异性问题,我们需要了解CRISPR复合物形成的每一步,廖说。

如今有研究证实病毒进化出的反制措施,即被称作抗CRISPR蛋白的抑制性蛋白,能够被用来改进作为一种基因治疗工具的CRISPR-Cas9,从而降低可能导致不良副作用的脱靶基因编辑。

日前,美国加州大学伯克利分校Jennifer
Doudna作为通讯作者之一在国际顶级学术期刊《自然》杂志发表一项最新研究:一种新型的小型CRISPR基因编辑工具CasX,CasX与蛋白Cas9较为相似,但比Cas9小很多。这是时隔7年之后,Doudna再次开发出新型基因编辑工具,或可和此前的Cas9形成有力竞争。

为了在人类医学中应用CRISPR,我们必须确保系统不会意外地针对错误的基因,柯说。我们的论点是,I型系统可能比CRISPR-Cas9更准确,因为它在行动之前检查更长的序列,系统将目标搜索和降级分为两个步骤,其间具有内置的安全功能。

为了研究 AcrIIA4 直接抑制 SpyCas9 活性的分子机制,课题组纯化出
SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4 复合物,并通过结构生物学研究方法解析了
SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4 复合物的晶体结构,该复合物结构揭示 AcrIIA4
蛋白构象是一个新的折叠,它结合在 SpyCas9 的 CTD、TOPO 和 RuvC
三个结构域形成的凹槽区域。该凹槽区域正是 SpyCas9 上的底物 PAM DNA
的结合位点;另外来自 AcrIIA4 的β1 折叠片前的 Loop 与 RuvC
活性位点接触也加强了 AcrIIA4 对 SpyCas9 的抑制作用。上述结构观察结果显示
AcrIIA4 和底物 PAM DNA 竞争性结合 SpyCas9,AcrIIA4 比底物 PAM DNA
具有更强的亲和力的实验结果进一步支持了结构观察的结果。接下来的生化实验结果进一步证实
AcrIIA4 结合 SpyCas9 后抑制底物 PAM DNA 结合 SpyCas9,从而拮抗 SpyCas9
的活性。10.Cell:首次发现CRISPR/Cas9基因编辑的“关闭开关”doi:10.1016/j.cell.2016.11.017

Doudna最后表示,“我们不仅仅在寻找下一对分子剪刀,我们想制造下一把瑞士军刀。”

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